Ensanchamiento de banda y eficacia de una columna cromatográfica

La eficacia de la separación de los componentes de una mezcla en una columna cromatográfica guarda una estrecha relación con la forma y la separación de los picos cromatográficos que se reflejan en el cromatograma.

Teoría de los platos teóricos

Considera que una columna cromatográfica está constituida por una serie de capas estrechas, discretas pero contiguas, denominadas platos teóricos, en los cuales se establece el equilibrio de distribución de cada soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Podemos definir, entonces, plato teórico como la longitud de una columna en la que el soluto experimenta un equilibrio completo entre las dos fase. El número de platos teóricos N de una columna de longutid L será:

Cuantos más platos teóricos formen una columna mayor será su eficacia (o lo que es lo mismo, cuanto menor sea la altura de plato mayor será la eficacia).

Como los picos cromatográficos tienen forma de curva gaussiana, la anchura de cada pico está directamente relacionada con la varianza (σ²) o la desviación estándar (σ). Por lo tanto, la altura de plato teórico H se puede definir en función de dichos parámetros como:

Se puede deducir que el número de platos teóricos se relaciona con parámetros que pueden deducirse fácilmente de un cromatograma:

Siendo t_R el tiempo de retención del soluto, ω el ancho de la base del pico y ω_0’5 es el ancho del pico a la mitad de su altura.

Conviene recordar que el plato teórico es una construcción artifical que nos permite explicar la forma de los picos y la velocidad de desplazamiento a través de la columna.

Teoría cinética de la cromatografía

Uno de los factores que afectan a la eficacia es el ensanchamiento de banda:

La teoría cinética de la cromatografía ofrece una explicación más realista que la teoría de platos y permite razonar cuantitativamente las formas y también los anchos de las bandas.

La forma gaussiana de una banda se atribuye a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las distintas moléculas a medida que descienden por la columna. Los factores que contribuyen a la anchura de banda son:

• Difusión en remolino o difusión de Eddy: las moléculas en disolución pueden atravesar la columna siguiendo trayectorias de distinta longitud con tiempos de retención diferentes; es directamente proporcional al diámetro de las partículas que componen el relleno de la columna y no se ve afectada por la velocidad de difusión de la fase móvil, cuando éstas son suficientemente altas.

• Difusión longitudinal: desde la zona central de la banda, en la que la concentración de solutos es mayor, hacia los extremos de la banda, donde la concentración es menor; es inversamente proporcional a la velocidad de flujo de la fase móvil, por lo que cuanto mayor es la velocidad de flujo de la fase móvil más breve es el periodo de tiempo que el analito reside en la columna (la difusión desde el centro de la banda hacia los extremos tiene menos tiempo para producirse). La difusión en los líquidos es muy lenta y su efecto es mucho menor que en los gases.

• Resistencia a la transferencia de masa entre la fase móvil y la fase estacionaria, ya que el equilibrio de distribución no es inmediato y no tiene el tiempo suficiente para establecerse, por lo que es proporcional a la velocidad de flujo.

Estos tres factores se relacionan con la altura de plato mediante la ecuación de van Deemter:

Si representamos la altura de plato frente a la velocidad de flujo de la fase móvil, vemos que existe una velocidad de flujo óptima para la cual la altura de plato se hace mínima y la eficacia es mayor:

Resumimos los factores que afectan al ensanchamiento (permiten optimizar el valor de H):

• Diámetro de las partículas que constituyen el relleno de la columna: al aumentar el diámetro aumenta la difusión en remolino

• Diámetro de la columna: al disminuir el diámetro de la columna se disminuye la contribución de la difusión de remolino a la altura de plato teórico.

• Coeficiente de difusión: su influencia es detectable en el caso de los gases, cuando la velocidad de flujo no es muy grande y el término de difusión longitudinal es determinante (aumenta con la temperatura); en el caso de los líquidos su efecto es mínimo.

• Velocidad de flujo de la fase móvil, ya que las velocidades suelen ser lo suficientemente elevadas como para que el término de transferencia de masar sea el que controla la eficacia de la columna.

• Otros factores, como la naturaleza de la fase móvil (su viscosidad, por ejemplo), el tamaño de la muestra o la rapidez de la inyección (una inyección lenta conduce al ensanchamiento de banda y disminuye la eficacia).

• En HPLC, se debe tener en cuenta el ensanchamiento de banda extracolumna.